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溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基 (Cetrimide Agar Medium) 是各國(guó)藥典普遍收載的控制菌檢查固體培養(yǎng)基, 用于銅綠假單胞菌的劃線分離培養(yǎng)。首先我們看一下溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的配方和作用：

（1）營(yíng)養(yǎng)成分：銅綠假單胞菌分解蛋白質(zhì)能力較強(qiáng)，而發(fā)酵糖類(lèi)能力較低，在培養(yǎng)基組分中明膠胰酶水解物和甘油為銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)提供碳、氮源、維生素和生長(zhǎng)因子。

（2）無(wú)機(jī)鹽：氯化鎂和硫酸鉀可以促進(jìn)綠膿菌素的產(chǎn)生，并維持滲透壓。

（3）選擇性培養(yǎng)的原理：溴化十六烷基三甲銨(cetrimide)作為一種季銨鹽陽(yáng)離子表面活性劑，通過(guò)改變細(xì)菌細(xì)胞的通透性，使細(xì)菌發(fā)生自溶或引起菌體蛋白質(zhì)變性沉淀，導(dǎo)致細(xì)菌死亡，有較強(qiáng)的抑菌作用。銅綠假單胞菌對(duì)溴化十六烷基三甲銨有一定的耐受性，因此，被用于銅綠假單胞菌的選擇培養(yǎng)。

（4）顏色：銅綠假單胞菌生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生兩種水溶性色素：黃色的熒光素和綠色的綠膿菌素，所以在溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上菌落呈黃綠色。

以疑似銅綠假單胞菌的溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)物或疑似菌分離純化的TSA培養(yǎng)物做后續(xù)生化試驗(yàn)。

（1）氧化酶試驗(yàn)

方法：挑取可疑菌落于潔凈的濾紙片上，滴加1%二鹽酸N，N-二甲基對(duì)苯二胺試劑，30秒內(nèi)出現(xiàn)粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色，為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)。若培養(yǎng)物不變色或僅顯粉色為陰性反應(yīng)。

原理：銅綠假單胞菌含有細(xì)胞色素氧化酶，該酶是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C使對(duì)苯二胺氧化，生成有色（如粉紅色或紫紅色）的醌類(lèi)化合物。

（2）綠膿菌素生成試驗(yàn)

方法：挑取可疑菌落接種在在綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基（PDP）斜面上，培養(yǎng)24小時(shí)，觀察斜面有無(wú)色素。如有色素，在試管內(nèi)加氯仿3.0～5.0mL，充分震搖，使培養(yǎng)物中的綠膿菌素提取在氯仿中，待氯仿提取液呈現(xiàn)綠色時(shí)，加1mol/L鹽酸約1mL，震搖后靜置片刻，上層鹽酸溶液中呈現(xiàn)粉紅至紅色實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，否則為陰性。

原理：銅綠假單胞菌能產(chǎn)生的綠膿菌素能被氯仿提取，且在水中溶解度比氯仿大，并且會(huì)發(fā)生可逆的氧化還原反應(yīng)，氧化時(shí)堿性呈藍(lán)色，酸性呈紅色。所以加入鹽酸溶液并震搖后，綠膿菌素會(huì)由氯仿轉(zhuǎn)移至鹽酸溶液中，并在酸性環(huán)境中呈紅色。
 

（3）硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)

方法：取可疑菌落接種在含小導(dǎo)管的硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)，35℃培養(yǎng)24小時(shí)，小導(dǎo)管內(nèi)有氣體產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，否則為陰性。

原理：銅綠假單胞菌是一類(lèi)兼性好氧、以有機(jī)碳作為能源的異養(yǎng)硝化菌，能通過(guò)產(chǎn)生的酶分四步還原硝酸鹽，將硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)狻?/span>

（4）42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)

方法：以接種環(huán)沾取少許TSA培養(yǎng)物于0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，制成菌懸液。將菌懸液劃線接種于TSA斜面上，置41±1℃培養(yǎng)培養(yǎng)24-48小時(shí)，斜面上如有菌苔生長(zhǎng)為陽(yáng)性反應(yīng)，無(wú)菌苔生長(zhǎng)為陰性反應(yīng)。銅綠假單胞菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

原理：致病性銅綠假單胞菌能在42℃條件下生長(zhǎng)，同屬的熒光假單胞菌和惡臭假單胞菌都不能生長(zhǎng)。

（5）明膠液化試驗(yàn)

方法：取可疑菌落穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，35℃培養(yǎng)24小時(shí)，取出后放2-8度冰箱10-30min，如果仍為液體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，否則為陰性。

原理：是利用銅綠假單胞菌產(chǎn)生胞外酶（明膠酶），使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動(dòng)的液體。

（1）供試品培養(yǎng)物經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶試驗(yàn)及綠膿菌素試驗(yàn)皆為陽(yáng)性者，即報(bào)告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌；
（2）供試品培養(yǎng)物氧化酶陽(yáng)性，鏡檢革蘭氏陰性桿菌，綠膿菌素試驗(yàn)陰性時(shí)硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)，42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)及明膠液化試驗(yàn)皆為陽(yáng)性時(shí)，報(bào)告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌；
（3）與（1）和（2）結(jié)果不符，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出銅綠假單胞菌。

原文鏈接：中國(guó)藥典中銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)及分離鑒定原理。